Le décryptage des fonctions géniques chez Medicago truncatula est aujourd’hui facilité par la mise à disposition d’une collection de plus de 21 000 mutants d'insertion du rétrotransposon Tnt1, dans le génome de la lignée sauvage R108, pouvant interrompre de nombreux gènes d’intérêt. Toutefois, chaque plante qui comporte une copie du Tnt1 dans un gène d’intérêt comporte aussi 5 à 70 insertionsTnt1 dans d’autres régions du génome rendant critique l’étude directe de ces mutants. Des rétrocroisements (ou Backcross) avec R108 s’avèrent donc nécessaires pour éliminer ces copies surnuméraires du Tnt1 et ainsi « nettoyer » le fond génétique avant d’étudier l’effet de la mutation. M. truncatula est une espèce autogame, dont les fleurs sont hermaphrodites et cléistogames, c’est-à-dire qu’elles s’autopollinisent lorsque la fleur est encore fermée. La maîtrise de ces rétrocroisements nécessitant beaucoup de minutie, nous décrivons ici un protocole que nous avons mis au point, simple et accessible à tous.